新手入门:质粒的转化,满满干货(质粒转化)

新手入门:质粒的转化,满满干货(质粒转化) 原理:在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后,受体细胞的膜通透性发生改变,质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子,进入到细菌体内而实现扩增。 感受

新手入门:质粒的转化,满满干货(质粒转化)

原理:在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后,受体细胞的膜通透性发生改变,质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子,进入到细菌体内而实现扩增。

感受态细胞:是指细胞自然或者经过诱导处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。在基因工程中,用于转化的受体菌(Restriction-Modification 缺陷变异株,以防止对导入外源DNA进行切割)一般通过诱导的方式实现。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大,直观的说,使得细胞膜表面出现一些孔洞,便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性,这种孔洞会被细胞自身所修复。

质粒的转化主要包含

Ⅰ感受态细胞制备

Ⅱ质粒DNA转化

Ⅲ质粒DNA的提取

(Ⅰ)感受态细胞制备

1)从新活化的大肠杆菌(常用DH5a)平板上挑取一个单菌落,接种于3ml LB培养基的试管中,37℃振荡培养过夜。

2)将该菌悬液按照1:100转接到液体培养基中,100ml,37℃振荡扩大培养,2~3h。当培养液开始浑浊时,间段性测试OD600,在数值为0.3-0.5时停止培养。

3)培养好的菌液转移到离心管中,冰上放置20min,0℃-4℃离心10min(4000r/min)。

4)弃掉上清,管口倒置以便培养液弃除干净。

5)加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml,小心悬浮沉淀细胞,冰浴30min。(氯化钙的浓度和纯度非常重要,不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率)

6)4℃离心10min(4000r/min)。

7)弃掉上清,用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞(冰上放置)片刻,感受态细胞制成。

8)可直接用于实验,4℃保存。也可分装长期保存,加入总体积15%的灭菌甘油,-70℃条件下保存。

(Ⅱ)质粒DNA的转化

1)取100ul新鲜制备的感受态细胞,加入质粒1ul DNA混匀,同时设置对照组(未加质粒,未加受体菌,已知具有转化活性的DNA)。

冷冻的感受态细胞要在冰上解冻,待管中最后一点冰融化后,迅即加入DNA. 解冻感受态细胞温度高于0℃,会降低转化效率。

2)冰浴30min,离心管放到42℃保温90s(不要摇动离心管)。冰浴时间短于30min ,可能影响转化率。然后迅速冰浴2min。

3)向离心管加800ulLB液体培养基,37℃振荡培养1h(150r/min)。37℃生长1小时能够对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有最佳效果。

4)取适当(50ul)的复苏细胞培养液,涂布在含抗性的选择性培养基上,将培养皿放置在37℃恒温培养箱中,正置30min。等菌液完全被培养基吸收后,倒置培养皿,在37℃恒温培养箱中,培养12~16h,出现菌落。

5)菌落结果:

① 无菌落

失败或者培养条件不充分

② 布满菌落,

呈苔样,失败。可能是抗生素浓度不够或失败。出现大菌斑,大多是由于霉菌污染所致

③ 布满菌落

浓度太高,失败

④ 出现菌落

符合要求

Ⅲ)质粒DNA的提取

质粒DNA的提取,由于其本身分子量小,一般采用碱裂解法提取。目前已研发出多种质粒提取试剂盒,实验操作简单,只需按照产品操作说明操作即可。不过对于其中主要试剂和作用的理解,能够避免实验过程中的一些问题,或者能够更好的解决问题。

各厂家提供的试剂盒中试剂不尽相同,一般的提取纯化试剂盒,主要包括以下试剂:

A. 细胞悬浮试剂: 主要作用是将菌体细胞悬浮起来。菌体悬浮不完全会导致裂解不完全,质粒的提取纯度和得率都会下降。通常需要在里面加入RNA酶(RNase A),RNA酶的作用很清楚,降解掉溶液中的RNA。通常选用Tris-HCl作为体系中pH稳定缓冲液。EDTA,金属离子螯合剂可以和细菌体内的金属离子结合而DNase的活性受到抑制。有的会有葡萄糖,可用来增加溶液粘度,保证菌体悬浮,延缓菌体沉淀时间。

B. 细胞裂解试剂:主要作用是裂解细胞,通过碱溶液的作用破坏细胞膜结构,使其双层膜结构改变,而导致细胞裂解。一般由一定浓度的NaOH和SDS组成。SDS的作用与后期中和过程中清除掉蛋白质等细胞杂质有关系。此步骤中需要注意的是,碱溶液的作用时间不能太长,也不可剧烈离心管,反之会导致碱破坏基因组DNA,导致同等大小的基因组DNA被提纯,造成污染。

C. 中和试剂:主要作用使中和掉细胞裂解试剂中的碱性物质,并去除掉其中的蛋白等杂质物质。组份有醋酸钾和醋酸,或者乙酸钾和冰乙酸。

D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多余的盐离子。DNA被试剂盒中的提取柱吸附之后,需要用wash buffer 洗脱掉多余的盐离子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇对后续酶切和测序反应会有影响,因此在后续洗脱DNA前,必须完全清除柱子中的乙醇。

E. 洗脱Buffer: 主要作用就是洗脱硅胶柱上的DNA样品。

1.柱平衡:在柱中加入2ml的平衡buffer,通过重力的作用,使平衡buffer都流出。

2.细胞收获:对于高拷贝质粒(培养液中,>2µg DNA/mL),吸取1-3ml培养液,离心去上清;对于低拷贝质粒(培养液中,<2µg DNA/mL),吸取10-15ml培养液,离心去上清。

3. 细胞悬浮:加0.4mL的细胞悬浮液(containing RNase A)悬浮细胞,并使其混匀。

4. 细胞裂解:加入0.4mL细胞裂解液,通过上下颠倒带盖子管子5次使其轻轻混匀,不要涡旋,之后在室温下放置5min.

5. 中和:加入0.4mL的中和试剂,立即混合均匀。当大的细胞颗粒被处理后,可能会进行更剧烈的摇动。但是,不要涡旋!~12,000xg离心混合物10min. 如果是采用的4°离心,上清液需要恢复到室温,再加入到柱子中。

6. 装柱:吸取步骤5中的上清液到平衡柱中。让混合液通过重力的作用流出,弃掉流出液。

7. 柱子清洗:2.5 mL的Wash Buffer洗脱柱子量次。每次清洗让清洗液通过重力的作用流出,弃掉流出液

8. 质粒DNA洗脱:加入0.9mL的Elution Buffer。让Elution Buffer通过重力的作用流出。不要强行弄出里面的液体。

9. 质粒DNA沉淀:加入0.63mL异丙醇去析出,混匀,~12,000xg at/4°C离心30min。小心的去掉上清,之后风干10分钟

10. DNA纯化:将管子中的DNA溶解到TE buffer中。将这些溶液转移到新管中。

重组质粒鉴定的方法:

① 双酶切后跑电泳;直接DNA电泳可判断整个DNA重组质粒是否正确。② PCR(插入片段在2kb以下时),然后电泳。

③ 送公司测序(最为准确的鉴定方式)。

影响转化效率的因素:

① 细胞状态和细胞密度: 培养菌最好选用传代次数少,且保存于-70℃或者-20℃。不要使用经过多次转接或者保存于4℃环境中培养菌。细胞生长密度以刚进入对数其为最好,可通过检测培养液的OD600值来判断,密度过高或者不足,都会影响转化效率。通常DH5α菌株在OD600的值为0.5左右,细胞密度在5*107个/ml左右比较合适。密度过高或者不足均会影响转化效率。

② 质粒的质量和浓度:转化的质粒DNA中,超螺旋状态的质粒,转化效率最好。在一定浓度范围内,转化的效率与添加质粒的浓度成正比。不过在添加的质粒的量和体积过大的时候,转化效率也会降低。质粒的分子量越大,通常来说转化率也会降低。

③试剂的质量:转化过程中所用的试剂,如氯化钙的浓度和纯度非常重要,不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率。

④防止杂菌和DNA污染:实验需要在无菌条件下进行,所用的仪器和试剂均需要灭菌处理,并防止在实验过程中引入其他污染。

⑤培养过程的条件:培养瓶中培养基的量关乎到菌体生长过程中的能量代谢。通常来说厌氧环境做出来的感受态的转化效率较低。建议500ml三角瓶液体培养基量不超过100ml, 250ml三角瓶液体培养基量不超过50ml. 培养基的pH值要适宜,接种前一般pH值在6.8-7.2,等培养结束后可以再测一下pH值最好在6.5以上(不低于6.0),表示菌体的代谢为有氧代谢,生长状态良好。培养基中的各种离子和温度,也对形成好的感受态有关系。

几种扩增常用感受态细胞:

① 普通骨架载体cDNA产品

DH5α:常用于质粒克隆,可用于蓝白斑筛选

TOP10:适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能够保证高拷贝质粒的稳定遗传。

TG1: 生长速度快,常用于噬菌体的制备,同时也可用于普通质粒的构建。

CopyCutter:适用于有毒克隆。

② 慢病毒载体质粒:

Stbl3: 是慢病毒载体系统推荐使用的菌株,可有效抑制长片段末端重复区的重组,降低错误重组的概率

Stable(NEB):可用于逆转录病毒/慢病毒载体系统扩增。

本文转至:傲锐东源

为了避免权属纠纷,特做如下说明:本站内容作品来自用户分享及互联网,仅供参考,无法核实真实出处,并不代表本网站赞同其观点和对其真实性负责,本网站仅提供信息存储空间服务,我们致力于保护作者版权,如果发现本站有涉嫌侵权的内容,欢迎发送邮件至youxuanhao@qq.com 举报,并提供相关证据,一经查实,本站将立刻删除涉嫌侵权内容。

原文标题:新手入门:质粒的转化,满满干货(质粒转化)

Like (0)
Previous 2024年11月25日 上午11:34
Next 2024年11月25日 上午11:51

相关推荐

发表回复

您的邮箱地址不会被公开。 必填项已用 * 标注

联系我们

400-800-8888

在线咨询: QQ交谈

邮件:youxuanhao@qq.com

工作时间:周一至周五,9:30-18:30,节假日休息

关注微信